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2 × Ezmax? Universal CloneMix
产品名称：2 × Ezmax? Universal CloneMix
规 格:50 rxns
货号：24305
单价：980元 促销价 399元
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产品说明书 常见问题 相关文献
2 × Ezmax? Universal CloneMix是基于同源重组原理开发的一步法单片段/多片段通用型无缝克隆试剂盒，Ezmax?系列重组克隆试剂盒属于非连接酶依赖型体系，载体自连背景极低。高度优化的2 × Ezmax? Universal CloneMix预混了增强型重组酶和重组反应所需缓冲液，可显著提高克隆的重组效率及对杂质的耐受程度，因此制备的高纯度线性化载体和插入片段可不纯化直接用于重组克隆，大大简化了实验操作。
本试剂盒可以将含有载体末端重叠区域的插入片段定向重组至任何载体的任何位点，不受酶切位点限制（特殊情况，如有毒基因的克隆或插入外源DNA后导致质粒本身不稳定等除外），可以插入单个片段，也可以一次插入多至5个顺序拼接的片段，载体末端与插入片段末端以及相邻插入片段末端之间需要15～25 bp能够相互同源重组的完全一致的序列。插入片段和线性化载体在重组酶作用下，仅需37℃反应5～30 min即可完成重组，重组产物不依赖连接酶直接转化至感受态细胞，所获得的阳性克隆率在95%以上。
组分 | 24305-01（50 rxns） |
● 2 × Ezmax? Universal CloneMix | 500 μL |
● Control Linearized plasmid + Insert fragment, Ampr a | 40 μL |
a.阳性对照Control中包含了4.6 kb的线性化载体和1 kb的插入片段，Amp抗性。使用时直接取10 μL Control加入10 μL 2× Ezmax? Universal CloneMix,即组成20 μL重组反应体系。
-20℃储存，≤ 0℃运输；
? 简单快速：一管式Mix体系，操作快捷简便，仅需37℃反应5～20 min即可实现快速重组。
? 高效：显著提高了克隆的重组效率及对杂质的耐受程度，可高效克隆50 bp～10 kb片段，阳性率>95%。
? 高度兼容性：可进行单片段同源重组、1~5个片段的快速无缝克隆、定点突变和高通量克隆等实验。
1. 克隆转化效率高，背景信号低，重组产物转化后平板上一般可形成数千个克隆，而无插入片段的阴性对照反应转化后只有数个单克隆形成，
2. 菌落PCR验证:三个多片段重组，挑取24个单克隆菌落PCR验证，分别验证三个外源片段，菌落PCR结果表示克隆阳性率可到95%以上。
A1:
引物由三部分组成：同源臂（15-25 bp，不计算酶切位点和残留碱基，GC含量40%-60%）+酶切位点（按需保留或舍弃）+特异性引物（引物Tm值由特异性序列决定，计算不包括同源臂和酶切位点的序列）。
载体的线性化方式有三种：双酶切、单酶切和反向PCR，优先选择双酶切。
A2:
2.1 引物设计不正确：即同源臂序列选择不合适，应避免选择含有高级结构的同源序列。同源臂的大小应为15-20 bp（不包括酶切位点），且GC含量应在40%-60%。同源臂的长度小于13 bp或者大于35 bp时，基本没有重组活性，长度大于25 bp时重组效率明显下降。
2.2 载体和外源DNA纯度较低：酶切或PCR扩增获得的载体/外源DNA片段应胶回收纯化，纯化的DNA应直接溶解于ddH2O中。
2.3 载体和外源DNA的摩尔比不佳：使用更精准的方法进行外源DNA和载体的定量（用Nanodrop的方法或琼脂糖凝胶电泳的方法进行定量），建议外源DNA片段：载体的摩尔比=2：1最佳。
2.4 感受态转化效率低：使用高效感受态（108 CFU/μg以上），并将转化产物全部涂平板。
2.5 平板配置错误：选择错误的抗生素或在固体LB培养基中加入了过量抗生素。涂板时检查载体的抗性并选择正确的抗生素和浓度。
2.6 设置阳性对照：用于排查是否因操作原因、感受态效率下降、试剂酶活力下降而导致的重组效率低。
2.7 实验反应条件：建议在PCR仪或者金属浴等仪器上进行反应，温度不准会导致重组效率下降。
2.8 反应体系不合适：建议20 μL反应体系，若直接使用酶切产物或PCR产物进行重组反应时，添加的体积不用超过重组反应总体积的1/5，否则会降低重组效率。
2.9 转化体积过量：重组产物的转化体积不应该超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。
A3：
3.1 抗性使用错误：24305试剂盒提供的对照载体的抗性为Amp+抗性。
3.2 感受态转化效率低：确保感受态转化效率＞107 cfu/μg，即将1 ng质粒转化至100 μL感受态细胞中，取1/10进行涂板，生长1000个菌斑，估算感受态转化效率为107 cfu/μg；
3.3 转化体系不合适：重组产物的转化体积不应超过感受态细胞体积的1/10，否则会降低转化效率。
A4
4.1 载体线性化处理不完全：通过阴性对照检测载体是否线性化完全，如果阴性对照长了很多克隆，可能是模板加入量过多或线性化处理不完全，可优化酶切体系，提高限制内切酶使用量并延长酶切反应时间；或者更换效率更高的限制性内切酶；胶回收酶切产物。回收产物溶解于ddH2O中。
4.2 环型质粒作为PCR扩增模板增加假阳性：使用Dpn I除去含有甲基化修饰的模板（例如从DH5ɑ、DH10B等细胞中抽提的质粒模板），模板投入量不宜过多<1 ng，否则可能导致Dpn I消化不完全从而造成假阳性；胶回收酶切产物。回收产物溶解于ddH2O中。
4.3 连入非目的片段：PCR扩增获得外源DNA片段时，产生非特异片段，建议胶回收PCR产物，回收产物溶解于ddH2O中。
A5
5.1 PCR扩增外源片段不特异：优化PCR扩增体系，提高特异性；胶回收PCR产物；重新设计引物；挑取更多的克隆鉴定。
5.2 反应体系中混入相同抗性的质粒：PCR扩增模板为环状质粒时，扩增产物应进行Dpn I处理或胶回收纯化。
5.3 反应体系中混入了其它序列：进一步纯化PCR产物，排除PCR产物不纯等因素造成的影响；使用干净的耗材，ddH2O等，避免试剂或耗材带来的污染。
5.4 测序样本数太少：需要多挑几个样本测序。
A6
6.1 PCR体系或程序不合适：没有目的条带也没有空载体条带，建议优化PCR体系、程序，同时设置阳性对照，以质粒作为PCR模板，排除人为配置体系错误可能性。或通过酶切验证是否插入外源片段。
6.2 重组反应失败：只有空载体的条带，说明重组反应失败。载体线性化不完全，建议优化酶切体系、延长酶切时间；检查引物设计等。
6.3 引物不正确：重新设计引物，若同源臂的长度小于13 bp或者大于35 bp，基本没有重组活性，长度大于25 bp，重组效率会有明显下降。或使用通用引物验证。
A7
7.1 PCR扩增过程发生突变：建议使用高保真的DNA聚合酶。
7.2 测序样本数 :如只测试一个样本，结果不一定可信，应多测试几个样本。
7.3 测序结果分析：检查突变处的测序信号是否正常，若为杂峰或双峰则不可信。
7.4 突变位置：若同源臂处发生碱基突变，考虑是引物合成问题，建议多挑取几个样本测序，或重新合成引物进行实验。
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